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    钠离子通道检测

    详细说明  表达各种钠离子通道亚型的稳定细胞系信息如下   钠通道稳定表达的HEK293细胞系在含有10% 胎牛血清及1.2mg/ml G418的DMEM培养基中培养,培养温度为37℃,二氧化碳浓度为5%。细胞传代:除去旧培养基并用PBS洗一次,然后加入1 ml TrypLE? Express溶液,37°C孵育1分钟。当细胞从皿底脱离,加

    1. 详细信息

    详细说明

    表达各种钠离子通道亚型的稳定细胞系信息如下   

      钠通道稳定表达的HEK293细胞系在含有10% 胎牛血清及1.2mg/ml G418的DMEM培养基中培养,培养温度为37℃,二氧化碳浓度为5%。

      细胞传代:除去旧培养基并用PBS洗一次,然后加入1 ml TrypLE? Express溶液,37°C孵育1分钟。当细胞从皿底脱离,加入5 ml 37°C预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中,1000rmp离心5分钟收集细胞。扩增或维持培养,将细胞接种于10厘米细胞培养皿,每个细胞培养皿,接种细胞量为3.5*105 cells(最终体积:10 ml)。

      为维持细胞的电生理活性,细胞密度必须不能超过80%。

      膜片钳检测,实验之前细胞用TrypLE™  Express分离,将3*103 细胞铺到盖玻片上,在24孔板中培养(最终体积:500μl),18个小时后,进实验检测。

    电生理检测方法

         用微电极拉制仪(P97,Sutter Instruments)将毛细玻璃管(BF150-86-10,Sutter Instruments)拉制成记录电极。在倒置显微镜(IX71,Olympus)下操纵微电极操纵仪(MP285,Sutter Instruments)将记录电极接触到细胞上,给予负压抽吸,形成GΩ封接。形成GΩ封接后进行快速电容补偿,然后继续给予负压,吸破细胞膜,形成全细胞记录模式。然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻。不给予漏电补偿。当全细胞记录的电流稳定后开始给药,每个药物浓度作用至5分钟后检测下一个浓度,在记录期间独立重复检测多个细胞。所有电生理实验均在室温下进行。实验数据由 EPC-10 放大器(HEKA)进行采集并储存于PatchMaster (HEKA)软件中。

     

    检测实验的刺激方案:

    QQ截图20161220094154.jpg


     

    数据质量标准

     

    (1) 串联电阻 ≤ 20 MΩ;

    (2) 封接电阻 ≥ 1 GΩ;

    (3) 起始电流幅度适宜;

    (4) 电流没有明显的自发性衰减(5分钟内自发性衰减小于5%);

    (5) 在膜电位为-80mV下无明显的漏电流 (漏电流 ≤ 100 pA)。

     

    数据分析

    首先将每一个药物浓度作用后的电流和空白对照电流标准化(1482294580536515.jpg),然后计算每一个药物浓度对应的抑制率(1-1482294580536515.jpg)。对每一个浓度计算平均数和标准误, 并用以下的方程计算每种化合物的半抑制浓度:1482294955110930.jpg

        用以上方程对剂量依赖效应进行非线性拟合, 其中c代表药物浓度,IC50为的半抑制浓度,h代表希尔系数。曲线拟合以及IC50的计算利用IGOR软件完成。


    NaV1.1


    Channel

    Nav1.1

    Gene

    SCN1A

    Sources

    human

    Catalog Ref.

    ICE-CHO-Nav1.1 + β1

    Expression system

    CHO

    Method

    whole cell patch clamp

    Reference inhibitor

    TTX (5.6nM±0.8nM)

    Distribution

    CNS and cardiac myocytes

    Related diseases

    Pain, Epilepsy, Anxiety, Depression Related, Degenerative Diseases, Dravet syndrome, West syndrome, familial autism




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    NaV1.2

    Channel

    NaV1.2

    Gene

    SCN2A

    Sources

    human

    Catalog Ref.

    ICE-HEK-Nav1.2

    Expression system

    HEK293

    Method

    whole cell patch clamp

    Reference inhibitor

    TTX (11.7±0.783nM)

    Target

    Pain, Seizure, Epilepsy, Anxiety, Depression Related, Degenerative Diseases


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    NaV1.3

    Channel

    Nav1.3

    Gene

    SCN3A

    Catalog Ref.

    ICE-HEK-Nav1.3

    Sources

    human

    Expression system

    HEK293

    Method

    whole cell patch clamp

    Reference inhibitor

    TTX (5.0±0.54nM)

    Target

    Pain, Epilepsy, Anxiety, Depression Related



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    NaV1.5

    Channel

    NaV1.5

    Gene

    SCN5A

    Catalog Ref.

    ICE-HEK-Nav1.5

    Sources

    human

    Expression system

    HEK293

    Method

    whole cell patch clamp

    Reference inhibitor

    TTX (1.0μM± 438.7nM)

    Target

    Brugada syndrome, long QT syndrome, progressive cardiac conduction disease ,dilated cardiomyopathy, sick sinus syndrome, and atrial fibrillation



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    NaV1.6


    Channel

    Nav1.6

    Gene

    SCN8A

    Catalog Ref.

    ICE-HEK-Nav1.6

    Sources

    human

    Expression system

    HEK293

    Method

    whole cell patch clamp

    Reference inhibitor

    TTX (1.9±0.302nM)

    Target

    Epilepsy, Degenerative Diseases,



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    NaV1.7


    Channel

    Nav1.7

    Gene

    SCN9A

    Catalog Ref.

    ICE-HEK-Nav1.7

    Sources

    human

    Expression system

    HEK293

    Method

    whole cell patch clamp

    Reference inhibitor

    TTX (1.3±0.508nM)

    Target

    Pain, Anxiety, Depression Related, erythromelalgia


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    NaV1.8 


    Channel

    NaV1.8

    Gene

    SCN10A

    Catalog Ref.

    ICE-HEK-Nav1.8

    Sources

    human

    Expression system

    HEK293

    Method

    whole cell patch clamp

    Reference inhibitor

    TTX (2.90±0.803nM)

    Target

    Pain, Anxiety, Depression Related


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